Το Σεπτέμβριο του 1885, ο Φρόυντ διορίστηκε με τον τίτλο του Privatdozent (υφηγητή) στο πανεπιστήμιο της Βιέννης, στο τμήμα Νευροπαθολογίας. Το Μάρτιο του 1885, ο Φρόυντ είχε υποβάλει επίσης αίτηση για μία ταξιδιωτική υποτροφία, την οποία τελικά κατάφερε να κερδίσει χάρη στη δυναμική παρέμβαση και στήριξή του από τον Ερνστ φον Μπρύκε. Στα πλαίσια αυτής της υποτροφίας, ταξίδεψε στο Παρίσι για δεκαεννέα εβδομάδες, αφιερωμένος σε μελέτες στη νευρολογία. Εργάστηκε κοντά σε έναν από τους σημαντικότερους νευροπαθολόγους της εποχής, τον Ζαν Μαρτέν Σαρκό, και θεωρείται πως την περίοδο αυτή ανακάλυψε την ψυχολογική πλευρά της
νευροπαθολογίας, στην οποία έστρεψε αργότερα το ενδιαφέρον του.
Τον Οκτώβριο του 1886 παρουσίασε ως όφειλε, την «ταξιδιωτική αναφορά» του, ενώπιον της Ιατρικής Εταιρείας, με τίτλο Περί ανδρικής υστερίας, η οποία αντιμετωπίστηκε με έντονη δυσπιστία.Από τον Απρίλιο του ίδιου έτους, δεχόταν ασθενείς σε ιδιωτικό του ιατρείο, εργαζόμενος επίσης ως νευρολόγος στο Ινστιτούτο Παιδιατρικής του καθηγητή Μαξ Κάσοβιτς, ενώ στις 13 Σεπτεμβρίου πραγματοποιήθηκε ο πολιτικός γάμος του με τη Μάρθα Μπέρναϋς. Η ιδιωτική πελατεία του Φρόυντ απαρτιζόταν κυρίως από νευρωτικούς ασθενείς, για τη θεραπεία των οποίων χρησιμοποίησε αρχικά τις ευρύτερα αποδεκτές μεθόδους της εποχής, όπως την ηλεκτροθεραπεία και τα ιαματικά λουτρά. Από το Δεκέμβριο του 1887, στράφηκε στην μέθοδο της ύπνωσης, με την οποία σημείωσε αρκετές επιτυχίες και έγινε υπέρμαχος της υπόθεσης του υπνωτισμού. Προκειμένου να βελτιώσει την τεχνική του στην υπνωτική υποβολή, ταξίδεψε το καλοκαίρι του 1889 στο Νανσύ, όπου παρακολούθησε τον Ωγκύστ Αμπρουάζ Λιεμπώ, ιδρυτή της Σχολής του Νανσύ, καθώς και τα πειράματα του Ιππολύτ Μπέρνχαϊμ.
Εξώφυλλο της πρώτης έκδοσης των Μελετών για την υστερία (1895).
Την περίοδο αυτή, ιδιαίτερης σημασίας υπήρξε η γνωριμία και φιλία του Φρόυντ με τον διακεκριμένο γιατρό Γιόζεφ Μπρόιερ (1842-1925). Ο Μπρόιερ είχε αναλάβει μία κλασική περίπτωση υστερίας, γνωστή στην ιατρική βιβλιογραφία ως η περίπτωση της «Άννας Ο.»[3] και είχε ανακαλύψει τυχαία πως όταν στη διάρκεια της ύπνωσής της, η ασθενής θυμόταν λεπτομερώς και εξέφραζε την αρχική κατάσταση που είχε οδηγήσει στο υστερικό σύμπτωμα, τότε αυτό εξαφανιζόταν. Αυτή την «καθαρτική μέθοδο» του Μπρόιερ εφάρμοσε ο Φρόυντ για πρώτη φορά το 1889, αποκτώντας σταδιακά σημαντική εμπειρία. Μαζί με τον Μπρόιερ δημοσίευσε αποτελέσματα των δοκιμών τους στις Μελέτες για την Υστερία (Studien über Hysterie, 1895), έργο από το οποίο θεωρείται πως αναδύθηκε η Ψυχανάλυση(ειδικότερα το κεφάλαιο με τίτλο «Περί του ψυχικού μηχανισμού των υστερικών φαινομένων»). Ο Φρόυντ επιθυμούσε να απελευθερωθεί από τη μέθοδο της ύπνωσης, την οποία απαρνήθηκε οριστικά ως θεραπευτική μέθοδο το 1896, και σταδιακά μετατοπίστηκε από την καθαρτική μέθοδο στην ψυχαναλυτική. Μέσα από μία τεχνική ελεύθερων συνειρμών του ασθενούς, παρατήρησε πως αναδυόταν στην επιφάνεια ένας σημαντικός αριθμός από μνήμες του, που αφορούσαν σεξουαλικές εμπειρίες, γεγονός που τον οδήγησε στη βαθύτερη διερεύνηση του ρόλου των σεξουαλικών παραγόντων στις νευρώσεις. Οι Μελέτες για την Υστερίαδεν έτυχαν θερμής αποδοχής από τον ιατρικό κόσμο και λίγο πριν την έκδοσή του βιβλίου, η συνεργασία του με τον Μπρόιερ διακόπηκε, κυρίως εξαιτίας της απροθυμίας του τελευταίου να ακολουθήσει τον Φρόυντ στη βαθύτερη διερεύνηση της σεξουαλικότητας ως αιτιολογία των νευρώσεων και να ασπαστεί τις ρηξικέλευθες ιδέες του. Την περίοδο 1893-98, δημοσίευσε περίπου δώδεκα εργασίες, από τις οποίες ξεχωρίζουν εκείνες για τις «αμυντικές νευροψυχώσεις», όπου ο Φρόυντ αναφέρεται στην «άμυνα» ή «απώθηση» ως κεντρικής σημασίας για τον «ψυχικό μηχανισμό». Ο ίδιος περιέγραψε την ψυχρή υποδοχή των ερευνών του γράφοντας:
«Η σιωπή όμως με την οποία υποδέχτηκαν τις ομιλίες μου, το κενό που σχηματίστηκε γύρω μου, οι υπαινιγμοί που έφθασαν ως εμένα, με έκαναν σιγά σιγά να καταλάβω ότι δεν μπορεί κανείς να υπολογίζει ότι απόψεις για τον ρόλο που παίζει η σεξουαλικότητα στην αιτιολογία των νευρώσεων θα τύχουν της ίδιας υποδοχής με εκείνη άλλων ανακοινώσεων».[4]
Περίπου το ίδιο διάστημα με τη διακοπή της συνεργασίας του με τον Μπρόιερ, ο Φρόυντ ανέπτυξε φιλία και συνεργάστηκε με τον Βίλχελμ Φλις (Wilhelm Fliess), ο οποίος ειδικευόταν στις ρινολαρυγγικές παθήσεις, ωστόσο τα ενδιαφέροντά του επεκτείνονταν ευρύτερα στην ιατρική και τη βιολογία. Ο Φλις έγινε κυρίως γνωστός για τις θεωρίες του πάνω στην σεξουαλική περιοδικότητα των ζωικών δραστηριοτήτων,[5] απόψεις για τις οποίες έδειξε προσωρινά ενδιαφέρον ο Φρόυντ. Η φιλία τους διήρκεσε περίπου μέχρι το 1900 και χαρακτηρίζεται περισσότερο ως μία εσωτερική ανάγκη του Φρόυντ,[6] καθώς στο πρόσωπο του Φλις ανακάλυψε έναν ένθερμο υποστηρικτή του έργου του. Η συμβολή του στη διαμόρφωση των ιδεών του Φρόυντ είναι αμφιλεγόμενη.
H περίοδος μέχρι το 1906 υπήρξε εν γένει μία από τις δημιουργικότερες φάσεις στη ζωή του Φρόυντ, κατά την οποία διαμόρφωσε αρκετές από τις καινοτόμες θεωρίες του, παρά το γεγονός πως βρισκόταν σχεδόν απομονωμένος από τον υπόλοιπο ιατρικό κόσμο. Ιδιαίτερης αξίας θεωρείται η ανακάλυψη του οιδιπόδειου συμπλέγματος, το οποίο υποδηλώνει την αγάπη κάθε παιδιού για τον ένα γονιό και τη ζηλότυπη εχθρότητα προς τον άλλο. Η σύλληψη του οιδιπόδειου συμπλέγματος καταγράφεται σε επιστολές του το 1897, την ίδια περίπου περίοδο που ο Φρόυντ ξεκίνησε την αυτοανάλυσή του. Στις 4 Νοεμβρίου του 1899, εκδόθηκε επίσης ένα από τα σημαντικότερα έργα του και κατά πολλούς το κορυφαίο βιβλίο του, Η Ερμηνεία των Ονείρων (γερμ.:Die Traumdeutung), με βασικό θέμα τη διερεύνηση του ονείρου ως εκπλήρωση μίας επιθυμίας. Βασική του θέση ήταν ότι το όνειρο (ακόμη και οι εφιάλτες) αποτελεί πάντοτε την εκπλήρωση μιας ασυνείδητης επιθυμίας, η έκφραση της οποίας όμως λογοκρίνεται πριν γίνει συνειδητή και παραμορφώνεται με διάφορους μηχανισμούς, όπως η μετάθεση και η χρήση συμβόλων. Το βιβλίο αγνοήθηκε για περίπου μία δεκαετία πριν αρχίσει να αναγνωρίζεται η αξία του, περίοδο κατά την οποία εμφανίστηκαν λίγες και ως επί το πλείστον περιφρονητικές κριτικές. Ακολούθησε ένα από τα πιο γνωστά βιβλία του, Για την ψυχοπαθολογία της καθημερινής ζωής (Zur Psychopathologie des Alltagslebens), δημοσιευμένο το 1904, καθώς και οι Τρεις πραγματείες για τη θεωρία της σεξουαλικότητας (Drei Abhandlungen zur Sexualtheorie) του 1905, βιβλίο που προκάλεσε ιδιαίτερη αίσθηση, ενισχύοντας σε μεγάλο βαθμό την αντιδημοτικότητα του Φρόυντ, ειδικότερα για τον ισχυρισμό πως κάθε παιδί γεννιέται με σεξουαλικές ενορμήσεις.